下面讓我們一(yi)起來了(le)解一(yi)下腺苷酸環化酶的電鏡酶細(xi)胞化學試驗方法

　　腺苷酸環(huan)化酶主(zhu)要分布于細胞質膜、核(he)膜和內質網膜上。它也是一(yi)種磷(lin)酸酶，能催(cui)化ATP形成3'，5'-環(huan)磷(lin)酸腺苷(cAMP)并釋放出焦磷(lin)酸。

　　Howell等人(1972)首先用(yong)亞(ya)胺二磷酸(suan)腺苷(AMP-PNP)作底物(wu)，成(cheng)功地(di)對(dui)動物(wu)細胞中的腺苷酸(suan)環(huan)化酶(mei)進(jin)行了定位。現已確(que)認，在(zai)未固定和固定的組織(zhi)中，ATP-PNP是腺苷酸(suan)環(huan)化酶(mei)的專一性底物(wu)，在(zai)腺苷酸(suan)環(huan)化酶(mei)的作用(yong)下，能生成(cheng)cAMP和PNP，后者與(yu)捕捉鉛離子反應，生成(cheng)一種不(bu)溶(rong)性的電子密(mi)度很高的產(chan)物(wu)。但鉛能在(zai)一定程度上抑(yi)制酶(mei)活性，為克服這(zhe)一缺點， Fujiomto等(1981)設計了使(shi)用(yong)二鉀亞(ya)砜(DMSO)的*法。下面介紹的是Fujimoto等人使(shi)用(yong)的DMSO的*法。

　　固定:配制固定液(ye)的(de)緩沖液(ye)使(shi)用0.1M pH為7.4的(de)二(er)甲(jia)胂酸(suan)鈉緩沖液(ye)，內含8%蔗糖、5%的(de)DMSO。

　　固(gu)定液(ye)配方(fang): 2%多(duo)聚甲醛(quan)和0.25%戊(wu)二醛(quan)混合液(ye)。對于肝(gan)臟(zang)來說(shuo)，1%以上的戊(wu)二醛(quan)固(gu)定時，可導致明顯的酶失活(huo)。但若加5%的DMSO，酶活(huo)性能較好保(bao)存(cun)。總體(ti)來說(shuo)，多(duo)聚甲醛(quan)與戊(wu)二醛(quan)的濃度應因組織而異。一般在0~4℃固(gu)定2小時或室(shi)溫固(gu)定1小時。

　　洗滌:用配制固定液相(xiang)同(tong)的緩沖(chong)液漂洗1小時~過夜，期間更換緩沖(chong)液數(shu)次;而后進行厚切片;

　　孵(fu)育:配方及條件見\ref,

　　作(zuo)為(wei)腺(xian)苷酸(suan)環化酶(mei)特異(yi)底(di)物(wu)的(de)AMP-PNP在室溫中或長期冷凍保存時，ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等(deng)化合物(wu)容(rong)易增多，應引起注意(yi)。左旋(xuan)咪(mi)(mi)唑的(de)加(jia)入是由于(yu)底(di)物(wu)AMP-PNP 容(rong)易受到組織的(de)堿(jian)性(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶(mei)分解，加(jia)入左旋(xuan)咪(mi)(mi)唑能抑(yi)制該(gai)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)(xing)，在堿(jian)性(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)高(gao)的(de)組織內，左旋(xuan)咪(mi)(mi)唑的(de)濃度等(deng)因素需特別注意(yi)考(kao)慮。氟(fu)化鈉(na)為(wei)腺(xian)苷酸(suan)環化酶(mei)的(de)激活(huo)劑，應根據組織不同進行(xing)前處(chu)理(li)后，將(jiang)氟(fu)化鈉(na)加(jia)入到孵育液中。

　　后(hou)固定:后(hou)固定前，必須(xu)用不含(han)DMSO的二甲胂酸鈉緩沖液(ye)進行充分(fen)洗滌。

　　殘存的(de)(de)DMSO可以與鋨(e)酸(suan)(suan)(suan)反(fan)應，產生(sheng)擴散性的(de)(de)微細顆(ke)粒(li)。后(hou)(hou)固定(ding)(ding)(ding)用二(er)(er)甲胂酸(suan)(suan)(suan)鈉(na)緩沖液配制的(de)(de)1%~2%的(de)(de)鋨(e)酸(suan)(suan)(suan)。鋨(e)酸(suan)(suan)(suan)后(hou)(hou)固定(ding)(ding)(ding)時(shi)(shi)對酶(mei)反(fan)應產物(wu)有(you)一定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)影響，有(you)人認為固定(ding)(ding)(ding)時(shi)(shi)間(jian)不應超過(guo)10min，超過(guo)后(hou)(hou)可引起酶(mei)反(fan)應產物(wu)顆(ke)粒(li)變粗變大(da)、擴散，有(you)時(shi)(shi)由(you)于全部溶(rong)出而導致(zhi)*沒有(you)反(fan)應產物(wu)的(de)(de)陰性結果(guo)。因此認為用鋨(e)酸(suan)(suan)(suan)固定(ding)(ding)(ding)時(shi)(shi)間(jian)最好控制在5分(fen)鐘內。也有(you)用2~4%的(de)(de)戊二(er)(er)醛(quan)代替鋨(e)酸(suan)(suan)(suan)進行后(hou)(hou)固定(ding)(ding)(ding)。

　　對照實驗(yan)中可除去底物AMP-PNP，也(ye)可在(zai)對照實驗(yan)的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。